人類卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection， ICSI）技術(shù)開(kāi)展至今已有30余年。其最初主要應(yīng)用于針對(duì)嚴(yán)重少、弱、畸形精子癥導(dǎo)致的男性不育患者的治療，但隨著未成熟卵體外培養(yǎng)、卵子冷凍、胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)等輔助生殖技術(shù)的開(kāi)展， ICSI使用比例已大幅提升。雖然目前ICSI技術(shù)相對(duì)成熟，但仍有很多細(xì)節(jié)值得關(guān)注和完善。為規(guī)范與優(yōu)化人類輔助生殖技術(shù)從業(yè)者的ICSI操作，由中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)發(fā)起，并聯(lián)合全國(guó)多家生殖醫(yī)學(xué)中心共同編撰了本共識(shí)。
01 ICSI的適應(yīng)證
01. 男性因素
① 極重度少精子癥及弱精子癥，即精子濃度<1×106/mL 及精子前向運(yùn)動(dòng)百分率<1%，處理后的前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)不足 100 萬(wàn)。
② 特殊類型畸形精子癥，如圓頭精子癥、大頭精子癥、無(wú)頭精子癥及精子鞭毛多發(fā)形態(tài)異常。
③ 精子功能異常。
④ 射精功能障礙。
⑤ 精子免疫性因素。
02. 非男性因素
① 需行 PGT 周期；
② IVM 周期；
③ 卵子凍融周期；
④ 不明原因前次常規(guī)IVF周期完全受精失??；
⑤ 前次周期卵子普遍存在透明帶異常。
應(yīng)將ICSI作為上述男性與非男性因素的授精方式。對(duì)于常規(guī) IVF 授精有污染史且未能抗菌治愈的病例，仍然存在再次 IVF授精污染風(fēng)險(xiǎn)，可嘗試選擇ICSI。
02 ICSI周期中正常及常見(jiàn)異常形態(tài)卵子
通常情況下，僅對(duì)出現(xiàn)第一極體（Pb1）的核成熟卵子進(jìn)行 ICSI 授精。本共識(shí)整理了正常及常見(jiàn)異常形態(tài)的卵子以作參考，詳見(jiàn)圖1。
注：COC示卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物；Pb1示第一極體；ZP示透明帶；PVS示卵周間隙
圖1 人類正常及常見(jiàn)異常卵子
A示COC（成熟卵子，卵丘細(xì)胞松散，箭頭所示為Pb1）；B示COC（未成熟卵子，卵丘細(xì)胞致密，未見(jiàn)Pb1）；C示COC（退化卵子且透明帶破裂）；D示正常形態(tài)卵子；E示偏振光顯微鏡下正常形態(tài)卵子，紡錘體（箭頭所示）位于極體正下方；F示MⅠ卵子；G示GV卵子；H示胞質(zhì)粗糙，顆粒感明顯且均勻；I示胞質(zhì)可見(jiàn)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)簇，光滑似圓盤；J示胞質(zhì)多發(fā)空泡（呈凹陷感，最大空泡直徑約16 μm，箭頭所示）；K示胞質(zhì)細(xì)胞器聚集，中央?yún)^(qū)域顆粒感明顯；L示異常ZP，呈瓊脂/蠟樣、無(wú)PVS、胞質(zhì)出現(xiàn)折光體（箭頭所示，約5 μm）；M示異常ZP，邊緣呈鋸齒狀，Pb1呈月牙狀（箭頭所示），無(wú)PVS；N示ZP增厚（>20 μm為增厚）；O示ZP著色，透明度下降（箭頭所示卵子）；P示PVS增大（至少可以容納2個(gè)正常大小的Pb1）；Q示ZP夾層（箭頭所示）；R示PVS內(nèi)大量顆粒碎片；S示巨大Pb1（長(zhǎng)徑約80μm）；T示多Pb1且較大；U示Pb1碎片化且PVS增大；V示連體卵子；W示胞膜不規(guī)則；X示巨大卵子（箭頭所示，總體平均直徑約230 μm，胞質(zhì)平均直徑約150μm），雙Pb1，胞質(zhì)細(xì)胞器聚集；Y示長(zhǎng)橢圓形巨大卵子；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)簇（SERc）、大空泡（直徑>14 μm）或多發(fā)小空泡、胞質(zhì)細(xì)胞器聚集、鋸齒或蠟樣透明帶以及多重異常形態(tài)卵子會(huì)對(duì)受精、胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局產(chǎn)生較大的負(fù)面影響，但部分卵子通過(guò)ICSI仍然可以獲得健康活產(chǎn)嬰兒，因此建議這部分卵子進(jìn)行特殊標(biāo)記并不作為移植選擇。
03 卵子的顯微注射
01. 顯微操作系統(tǒng)
顯微操作系統(tǒng)應(yīng)安置在百級(jí)凈化區(qū)域（ISO Class5），該區(qū)域應(yīng)相對(duì)獨(dú)立、安靜且人員流動(dòng)較小，遠(yuǎn)離門口和傳遞窗口，盡量避免高效濾器出風(fēng)口直吹操作臺(tái)面和操作人員，這樣可以保障操作環(huán)境穩(wěn)定，使操作人員免受外界因素干擾而更加專注。除此之外，與顯微操作相關(guān)的培養(yǎng)箱應(yīng)盡量靠近顯微操作設(shè)備，增加操作流程的順暢度，減少配子或胚胎在外界暴露的時(shí)間。
02. ICSI操作皿的制備
ICSI操作皿各類微滴的具體布局沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，可根據(jù)個(gè)人操作習(xí)慣制備，但應(yīng)遵循如下基本原則及參考技巧：①操作液微滴應(yīng)盡量集中于皿的中部，以避免操作針下降時(shí)觸碰皿的側(cè)壁；②如果是極重度少、弱精或睪丸/附睪精子，也可不用制作PVP微滴，直接將精子懸液制成微滴；③建議雙人制皿，及時(shí)覆蓋培養(yǎng)油，避免因揮發(fā)而改變液滴滲透壓。
03. 顯微操作針的安裝
① 安裝時(shí)避免注射針內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡；
② 操作針在插入持針器過(guò)程中如遇到較大阻力時(shí)切勿強(qiáng)行插入，應(yīng)檢查持針器管路內(nèi)是否有破損的玻璃殘留物；
③ 若發(fā)現(xiàn)操作針吹吸不順暢，尤其是無(wú)法穩(wěn)定控制注射針內(nèi)的精子時(shí)，應(yīng)首先檢查裝針位置和水晶螺母松緊度；當(dāng)確保裝針到位并擰緊水晶螺母后上述問(wèn)題仍未解決，應(yīng)考慮是水晶螺母內(nèi)的密封膠墊出現(xiàn)了老化或破損，需及時(shí)進(jìn)行更換；
④ 將安裝好的操作針在低倍物鏡（4×或10×）下進(jìn)行調(diào)焦，并使注射針和持卵針成一條直線；
⑤ 注射針前端角度并非與皿底完全平行，但角度不宜過(guò)大，以成功壓停運(yùn)動(dòng)精子的最小角度為佳。
04. 卵子的脫顆粒
建議卵子在透明質(zhì)酸酶中作用的時(shí)間<30 s。脫顆粒的總時(shí)間控制在1~2 min內(nèi)，因此不建議一次操作過(guò)多的卵子（5~8 枚為宜）。建議使用口徑（內(nèi)徑）遞減的燒拉制成的玻璃吸管或商品化剝卵針逐步進(jìn)行卵子脫顆粒：通常先用管口燒制光滑的巴斯德吸管在酶中進(jìn)行吹吸消化、隨后用內(nèi)徑200 μm左右的吸管轉(zhuǎn)移至干凈配子緩沖液中、然后用內(nèi)徑 160~180 μm 的吸管/撥卵針進(jìn)行“粗拆”、最后用內(nèi)徑 135~140 μm的吸管/撥卵針將顆粒細(xì)胞剝離干凈；脫顆粒后的卵子應(yīng)進(jìn)行充分洗滌，最后移入卵裂培養(yǎng)液中孵育至少1 h。
05. 顯微注射基本步驟
圖2 顯微注射過(guò)程（200×）
A示輕壓精子尾部中段或下段進(jìn)行制動(dòng)；B示調(diào)整 Pb1位置并固定卵子，針尖抵住透明帶后將精子移到針尖處；C示突破透明帶并刺入胞質(zhì)，但此時(shí)并未破膜；D示當(dāng)胞質(zhì)瞬時(shí)流入針內(nèi)時(shí)（破膜），即刻終止負(fù)壓；E示精子進(jìn)入胞質(zhì)，應(yīng)避免注入PVP
將精子注入胞質(zhì)內(nèi)是受精的關(guān)鍵。精子頭頸部順利滑出針尖，并且撤針后不隨胞膜的回彈而持續(xù)后移，即標(biāo)志著精子成功注入胞質(zhì)。當(dāng)觀察到破膜成功，但精子在注入時(shí)明顯受阻而依然停留在針尖內(nèi)側(cè)，并且在撤針后精子會(huì)沿穿刺通道緩慢向外移動(dòng)，表明回吐的胞膜“褶皺”阻礙了精子的進(jìn)入。如遇此種情況，可以進(jìn)行二次回吸胞質(zhì)，然后再重新注入精子；或者平行于第一次穿刺通道位置進(jìn)行二次穿刺，重新破膜后再注入精子。經(jīng)過(guò)第一次穿刺拉伸后的胞膜，通常在二次穿刺時(shí)僅需輕微負(fù)壓甚至無(wú)需負(fù)壓即可破膜。推薦在200 ×~400 ×放大倍數(shù)下進(jìn)行精子的制動(dòng)和卵子的注射。
06. 精子的制動(dòng)
對(duì)于精子的制動(dòng)，成功阻止前向運(yùn)動(dòng)及尾部擺動(dòng)即可；精子制動(dòng)后盡快進(jìn)行注射，不建議提前制動(dòng)足夠數(shù)量的精子后再進(jìn)行注射。對(duì)于極重度少精患者，為避免卵子外界暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可以提前抓取足夠數(shù)量的精子，但不提前進(jìn)行制動(dòng)。
07. ICSI 過(guò)程中極體擺放的位置
建議將 Pb1 置于 12 點(diǎn)或 6 點(diǎn)位置，于3點(diǎn)或9點(diǎn)位置（左手進(jìn)針者）進(jìn)行穿刺。使用顯微注射針輕壓卵子透明帶，使Pb1旋轉(zhuǎn)至穿刺焦距平面最清晰位置。
08. 注射針穿刺深度
建議穿刺深度為胞質(zhì)直徑的1/2~2/3為宜。但對(duì)于發(fā)生突然破膜（無(wú)穿刺漏斗形成）的卵子則不建議繼續(xù)進(jìn)針，可直接將精子注入胞質(zhì)。
04 受精觀察
盡管有研究報(bào)道，通過(guò) PGT 篩選正常雙親二倍體胚胎可以獲得健康嬰兒，但考慮到較低的正常胚胎率和較高的檢測(cè)成本，建議丟棄ICSI-1PN 來(lái)源的胚胎。ICSI-0PN 來(lái)源的胚胎可能是原核出現(xiàn)過(guò)早或過(guò)晚而錯(cuò)過(guò)了觀察時(shí)間。鑒于高質(zhì)量 ICSI-0PN 來(lái)源的胚胎具有與 ICSI-2PN 來(lái)源胚胎近似的正常染色體發(fā)生率、雙親二倍體比例以及妊娠結(jié)局，建議對(duì)高質(zhì)量 ICSI-0PN來(lái)源胚胎行囊胚培養(yǎng)，形成可利用囊胚，經(jīng)充分知情同意后再行移植或冷凍保存。
05 ICSI特殊情況的應(yīng)對(duì)及其他細(xì)節(jié)
01. 第一次減數(shù)分裂（MⅠ）
中期卵子的處理
對(duì)于卵子成熟率較低（<50%）或高齡（≥40歲）的患者，可對(duì) MⅠ卵進(jìn)行短時(shí)間的體外培養(yǎng)（取卵后8 h內(nèi)），從而增加卵子利用率及可用胚胎數(shù)量，但鑒于其較高的非整倍體率及不良妊娠結(jié)局，有條件的可酌情對(duì)形成的囊胚進(jìn)行PGT-A檢測(cè)。
02. 易退化卵子的應(yīng)對(duì)
脫顆粒過(guò)程中應(yīng)避免高頻率、大幅度吹吸，剝卵針內(nèi)徑不應(yīng)<135 μm；避免過(guò)度剝離顆粒細(xì)胞，殘余顆粒細(xì)胞不影響卵子的觀察和注射即可；當(dāng)出現(xiàn)精子或胞質(zhì)黏針嚴(yán)重時(shí)，應(yīng)及時(shí)更換ICSI針；ICSI針前端水平角度不宜過(guò)大；對(duì)于卵膜脆性較高的卵子，建議適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間，再行ICSI。
03. 無(wú)透明帶卵子的處理
圖3 人類無(wú)透明帶卵子行卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射及胚胎發(fā)育情況
A示固定卵子；B示穿刺胞膜；C示注入精子；D示第1天正常受精；E示第3天 8-細(xì)胞胚胎；F示第5天囊胚
ICSI過(guò)程中，Holding針負(fù)壓不宜過(guò)大，ICSI針刺入不宜過(guò)淺；由于觀察不到 Pb1，有條件的可以利用偏振光顯微鏡確認(rèn)紡錘體位置后再行 ICSI；ZFOs 來(lái)源的卵裂期胚胎在移植或冷凍過(guò)程中容易發(fā)生解體，因此建議進(jìn)行囊胚培養(yǎng)；為避免養(yǎng)囊換液過(guò)程中卵裂球分解，可以直接將培養(yǎng)微滴中的卵裂期培養(yǎng)液移除并重新注入囊胚培養(yǎng)液，或者使用一步培養(yǎng)液；建議對(duì) ZFOs 進(jìn)行單滴培養(yǎng)或應(yīng)用時(shí)差成像系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)。
04. ICSI完全受精失敗的應(yīng)對(duì)
AOA 應(yīng)謹(jǐn)慎應(yīng)用，建議對(duì)前次 ICSI受精完全失敗或受精率低下的患者進(jìn)行患者精子與供者卵子的交叉試驗(yàn)、鼠卵激活試驗(yàn)（MOAT）或精子的PLC ζ染色，來(lái)判斷
精源性或是卵源性O(shè)AD；可對(duì)Ⅰ型圓頭精子癥或精源性O(shè)AD的病例進(jìn)行AOA治療；常用化學(xué)法激活劑包括離子霉素、A23187以及氯化鍶。三者之間的效果比較尚存爭(zhēng)議，但對(duì)于單獨(dú)應(yīng)用上述3種激活劑臨床治療效果不佳的患者，可嘗試聯(lián)合應(yīng)用。
05. 完全不活動(dòng)精子的應(yīng)對(duì)
ICSI過(guò)程中，將完全不活動(dòng)精子中的活精子和死精子進(jìn)行區(qū)分至關(guān)重要，因?yàn)樗谰訜o(wú)法激活卵子而發(fā)生正常受精。常用的存活精子鑒別方法包括人工精子激活（ASA）、低滲膨脹試驗(yàn)（HOST）、激光輔助不動(dòng)精子選擇（LAISS）、精子尾部柔韌性測(cè)試（STFT）。
雖然上述四種方法存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)，但I(xiàn)VF實(shí)驗(yàn)室應(yīng)至少采用其中一種用于不動(dòng)精子的ICSI處理；鑒于ASA的安全性尚不明確，因此應(yīng)謹(jǐn)慎應(yīng)用；HOST和LAISS可以作為ASA無(wú)效病例的備選方法，但尚無(wú)證據(jù)表明兩者哪個(gè)更具優(yōu)勢(shì)，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室操作習(xí)慣及設(shè)備條件進(jìn)行選擇應(yīng)用；STFT方法通?？梢越Y(jié)合HOST和LAISS方法使用。
當(dāng)使用 HOST時(shí)，精子在低滲液中暴露時(shí)間應(yīng)少于 30 s。
06. 精子的優(yōu)選
目前還沒(méi)有可靠的技術(shù)可以徹底篩除 DNA 碎片化的精子，并且這些技術(shù)的安全性和有效性有待商榷，因此不建議將上述方法進(jìn)行常規(guī)應(yīng)用；對(duì)于精子DNA 碎片指數(shù)（DFI）>20%~30% 且具有不良預(yù)后因素（高齡、卵巢功能低下、反復(fù)種植失敗/流產(chǎn)）的病例可以嘗試上述方法進(jìn)行精子的優(yōu)選，但由于相關(guān)研究缺乏前瞻性和隨機(jī)性，因此目前尚無(wú)法推薦好的精子優(yōu)選技術(shù)；若DFI持續(xù)較高且反復(fù) ICSI 周期失敗2次以上可考慮從睪丸中獲取精子。
07. 其他細(xì)節(jié)
（1）卵子孵育、脫顆粒及ICSI時(shí)機(jī)的選擇：
取卵后 2~6 h 或人絨毛膜促性腺激素（hCG）扳機(jī)后 38~42 h 內(nèi)進(jìn)行脫顆粒及 ICSI；建議脫顆粒后孵育 1 h再行ICSI；預(yù)后不良的患者可以利用紡錘體觀測(cè)儀評(píng)估卵子核-質(zhì)同步性，對(duì)于未見(jiàn)紡錘體的 MⅡ卵可以適當(dāng)延后ICSI時(shí)間。
（2）PVP的濃度：
建議根據(jù)個(gè)人技術(shù)能力和習(xí)慣將PVP進(jìn)行適當(dāng)稀釋，5%的PVP是很好的選擇，一方面降低高濃度PVP對(duì)卵子發(fā)育潛力的負(fù)面影響，另一方面也幾乎不增加精子制動(dòng)操作的時(shí)長(zhǎng)。
（3）透明質(zhì)酸酶的濃度：
商品化透明質(zhì)酸酶（80 U/mL）可以直接應(yīng)用。同時(shí)建議在不影響脫顆粒效果和時(shí)間的前提下可以進(jìn)行稀釋應(yīng)用。
質(zhì)控指標(biāo)
根據(jù)2017年維也納共識(shí)及2018年中國(guó)胚胎實(shí)驗(yàn)室關(guān)鍵指標(biāo)質(zhì)控專家共識(shí)，將ICSI實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控指標(biāo)的計(jì)算方式及標(biāo)準(zhǔn)歸納如下，詳見(jiàn)表1。
注：正常受精率和卵子退化率為關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)；1PN率為一般質(zhì)控指標(biāo)；退化卵子定義為ICSI過(guò)程中出現(xiàn)胞質(zhì)崩解及受精觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)凋亡的卵子；ICSI示卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射；PN示原核；Pb示極體
① 新人要充分了解ICSI的理論基礎(chǔ)及影響因素。只有熟練掌握撿卵、胚胎轉(zhuǎn)移、卵子脫顆粒等基礎(chǔ)技能的新人才可以開(kāi)始訓(xùn)練 ICSI 操作；
② 訓(xùn)練期間可以使用未受精或廢棄的IVM卵子進(jìn)行練習(xí)。當(dāng)新人的平均每卵操作時(shí)間（從制動(dòng)精子開(kāi)始，至注射結(jié)束）與帶教胚胎學(xué)家相當(dāng)、廢棄IVM 卵子受精率>60%、卵子退化率<10% 時(shí)，方可進(jìn)行患者卵子的操作；
③ 新人在正式操作患者卵子初始階段，可以注射獲卵數(shù)較多患者（>10枚卵子）的部分卵子。至少注射 50 枚卵子后，當(dāng)受精率及卵子退化率與胚胎學(xué)家注射的同批卵子結(jié)果相當(dāng)時(shí)，方可進(jìn)行獨(dú)立操作。
